Realizacja operacji – etap 2
Zakres prac etapu 2 dotyczył badań ilościowo – jakościowych w czasie uprawy i po zbiorze uwzględniając wariantowość (odmiany groszku). W celu wyrównania jakości groszku przed zbiorem, co ograniczy straty podczas jego sortowania w zakładzie, na polu dokonywano analizy twardości i barwy surowca które są krytyczne dla jego jakości i dalszej przydatności. Opracowano w ten sposób mapę optymalnych parametrów wraz z wynikami analiz zróżnicowania genetycznego i składu chemicznego, co pozwoli na wybór najlepszych odmian groszku do etapu 3 pod względem uprawy i wydajności po obróbce wstępnej.
OPIS PRZEPROWADZONYCH ANALIZ
Analizy molekularne
W pierwszym kroku w katedrze Genetyki i Hodowli Roślin Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu zaprojektowano startery do reakcji qPCR. Do projektowania starterów wykorzystano sekwencje genów kodujących zestaw enzymów z grupy peroksydaz. Sekwencje pobrano z internetowych baz danych NCBI oraz Ensembl Plants. Dla każdego genu (każdej pary starterów) przeprowadzono łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) w gradiencie temperaturowym. Ustalono jedną temperaturę przyłączania starterów (annealingu), dla wszystkich genów. Temperaturę ustalono na podstawie analizy obrazów elektroforetycznych (zdjęć żeli agarozowych wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym np. Midori Green). W kolejnym kroku przeprowadzono 5 niezależnych reakcji PCR dla każdej pary starterów (czyli dla każdego genu badanego) aby zwiększyć objętość materiału genetycznego. Otrzymane produkty PCR w wyniku 5-krotnej amplifikacji zostały połączone i przeniesione do jednej probówki. Dzięki temu otrzymano objętość 100 µl materiału genetycznego wymaganą do reakcji qPCR. W kolejnym kroku namnożone DNA wymagało oczyszczenia, które przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu QIAquick PCR Purification Kit firmy QIAGEN, zgodnie z protokołem dołączonym przez producenta. Po oczyszczeniu ponownie sprawdzono koncentrację i czystość próbek z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop. W kolejnym kroku przeprowadzono analizy qPCR w dwóch powtórzeniach biologicznych, łącznie analizom poddano 90 próbek (15 genotypów x 3 powtórzenia biologiczne x 2 powtórzenia techniczne) i wykonywano krzywe wzorcowe. W celu wykonania analiz przygotowano rozcieńczenia dla każdego oczyszczonego amplikonu (próbki powielonego DNA). Najczęściej wykorzystywanym rozcieńczeniem było 1:10 000 000. Do przygotowania mieszaniny wykorzystano kit Supermix firmy BIO-RAD z zestawu SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix. Opracowanie statystyczne otrzymanych wyników przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Bio-Rad CFX Maestro.
Rezultatem prowadzonych analiz jest potwierdzenie w każdym z badanych materiałów, obecności genu kodującego peroksydazę. Ponadto dla każdej odmiany, dokonano szacowania ilości kopii wybranych genów kodujących peroksydazy.
 |
|---|
 |
 |  |
|---|
 |  |
|---|
 |
|---|
Ocena towaroznawcza groszku
W drugim etapie kontynuowano ocenę towaroznawczą groszku w Katedrze Zarządzania Jakością i Bezpieczeństwem Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu.
W Zgodnie z Norma Branżową (BN-84/8165-07), ziarno groszku przeznaczone do mrożenia poddano ocenie towaroznawczej polegającej na określeniu:
• Zawartości (%) ziaren uszkodzonych i zlepieńców trwałych,
• Barwy (ocena procentowego udziału ziaren żółtych i ze skazami),
• Wielkość ziaren,
• Zdrowotność,
• Smaku i zapachu,
• Konsystencji (twardość),
Ponadto w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oznaczono w groszku:
• Aktywność enzymatyczną metodą spektrofotometryczną zgodna z protokołem analitycznym zawartym w PN-80/R -7 5763 Warzywa świeże. Groch zielony
• Zawartość związków nierozpuszczalnych w alkoholu (AIS), gdzie zastosowano standardową metodę (metoda A) oznaczania substancji alkoholowo nierozpuszczalnych, które decydują o przydatności zielonego grochu na mrożonki i konserwy ( AO AC 1984, s. 608), oparta jest na ekstrakcji pulpy wodnej grochu 80-procentowym alkoholem oraz wielokrotnym przemywaniu alkoholem próbek na sączku i bezpośrednim wyliczaniu procentowej zawartości substancji nierozpuszczalnych w alkoholu. Metoda ta została porównana z metodą wodno-etanolową (metoda B) zmodyfikowaną w następujący sposób: sączenie zastąpiono wirowaniem próbek, uzyskując supernatant części rozpuszczalnych w etanolu. Procent wagowy składników rozpuszczalnych w etanolu (a) i nierozpuszczalnych w etanolu (y) obliczono ze wzoru: y = [100(s — a)]:[100 — a], gdzie s = procent wagowy suchej masy.
• Zanieczyszczenia chemiczne (mikotoksyny, pozostałości pestycydów). Jednocześnie wykonano analizę dziesięciu pestycydów (2,4 DDE, alfa-endosulfan, bifentryna, chlorpyrifos, dieldryna, fosalon, kaptan, keton endryny, siarczan endosulfanu oraz tolchlofos metylowy) i ich metabolitów w próbkach groszku metodą chromatografii gazowej sprzężonej z detektorem spektrometrii mass (GC-MS). Pestycydy wyekstrahowano, a następnie poddano izolacji z wykorzystaniem techniki SPE (metoda QuEChERS).
• Zanieczyszczenie mikotoksynami (trichoteceny grupy A i B, zearalenon, ochratoksyna A, aflatoksyny i fumonizyny) w zależności od zidentyfikowanych podczas wegetacji roślin chorób grzybowych. Analiza mikotoksyn została przeprowadzona po wcześniejszej ich ekstrakcji mieszaniną acetonitryl/woda 82:18 v/v. Następnie ekstrakty oczyszczono i rozdzielono za pomocą kolumienek SPE z wypełnieniem dedykowanym dla poszczególnych mikotoksyn. Analiza ilościowa mikotoksyn została przeprowadzona za pomocą chromatografii gazowej (GC-MS) oraz cieczowej UPLC-PDA/fluorymetryczny.
• Witaminy z grupy B, Zawartość witamin: B1, B2, B3, B6, B12 (tiamina, ryboflawina, niacyna, pirydoksyna, kobalamina) analizowano za pomocą systemu Aquity H UPLC wyposażonego w detektor Waters Acquity PDA (Waters, USA) po uprzedniej ekstrakcji enzymatycznej i kwasowej.
• Analiza zawartości witaminy C. Witaminę C analizowano po wcześniejszej ekstrakcji i stabilizacji za pomocą systemu Aquity H UPLC wyposażonego w detektor Waters Acquity PDA (Waters, USA) przy długości fali λ = 243 nm stosując kolumnę chromatograficzną ACQUITY APC BEH, 200 Å, 2,5 µm, 4,6 mm x 75 mm, z szybkością przepływu fazy ruchomej 0,4 ml/min. Fazą ruchomą był bufor fosforanowy o stęż. 40 mmol/dm3 przy pH 3,65; acetonitryl (90:10, v/v) z dodatkiem (1,5 mmol/dm3) bromku cetylotrimetyloamoniowego jako środka stabilizującego.
• Analiza zawartości witaminy A i E przy użyciu Aquity H UPLC system equipped with a Waters Acquity PDA detector (Waters, USA). Detekcję spektrofotometryczną do oznaczania witaminy A wykonano przy długości fali λ = 325 nm. Przed analizą przeprowadzono ekstrakcję z frakcji tłuszczowej surowca oraz rozdział witamin. Witaminy izolowano z surowca poprzez zmydlanie alkoholowym roztworem wodorotlen¬ku potasu z dodatkiem hydrochinonu jako przeciwutleniacza, następnie wytrząsano z częstotli¬wością 150 obr/min w temperaturze 45°C przez 60 min, po czym podniesiono tempe¬raturę do 70°C i zmydlano do momentu uzyskania jednorodnej mieszaniny. Po ostu¬dzeniu zmydlonej próbki do temperatury pokojowej, prowadzona została trzykrotnie ekstrak¬cja mieszaniną heksan: chloroform (2:1; v/v).
• Analiza zawartości witamin K1 (fitomenadion) oraz K3 (menachinon-6). Procedura bazowała na ekstrakcji próbek za pomocą dimetyloacetamidu, a następnie na przeprowadzeniu analizy chromatograficznej (HPLC) z wykorzystaniem kolumn C18 (kolumny z żelem krzemionkowym zmodyfikowanymi grupami o niskiej polarności, najczęściej grupami oktadecylowymi). Po czym przeprowadzana została detekcja spektrofotometryczna przy długości fali 333 nm. Wymywanie linii gradientu odbywało się za pomocą 50% acetonitryl – metanol (75:25 v/v) i wody, a następnie 100% acetonitryl – metanol przez 5 minut.
• Makro i mikroelementy Cu, Mn, Fe, K, P, Zn, Mg, Ca. Materiał mineralizowano za pomocą systemu mineralizacji mikrofalowej CEM Mars 5 Xpress (CEM, Matthews, NC, USA). Stężenie poszczególnych pierwiastków analizowano za pomocą płomieniowej spektrometrii absorpcji atomowej (Cu, Fe, Mn, Zn), atomowej spektrometrii emisyjnej (Mg, K, P, Ca) przy użyciu spektrometru AA Duo – AA280FS/AA280Z (Agilent). Technologies, Mulgrave, Victoria, Australia), wyposażonych w lampę Varian z katodą wnękową (HCL; Varian, Mulgrave, Victoria, Australia). Krzywe kalibracyjne przygotowano w czterech powtórzeniach na każde stężenie pierwiastków.
• Flawonoidy, kwasy fenolowe. Kwasy fenolowe oraz aglikony flawonoidowe oznaczono po wcześniejszej ekstrakcji i przeprowadzeniu podwójnej chydrolizy (kwasowej i zasadowej). Analiza ilościowa została przeprowadzona przy użyciu systemu UPLC Aquity klasy H wyposażonego w detektor Waters Acquity PDA (Waters, USA). Rozdział chromatograficzny przeprowadzony został na kolumnie Acquity UPLC® BEH C18 (100 mm x 2,1 mm, wielkość cząstek 1,7 μm) (Waters, Irlandia). Elucja prowadzona była gradientem stosując następujący skład fazy ruchomej: A: acetonitryl z 0,1% kwasem mrówkowym, B: 1% wodna mieszanina kwasu mrówkowego (pH=2). Zawartość kwercytyny oraz jej pochodnych oznaczono przy użyciu wzorca wewnętrznego przy długościach fali λ=320 nm. Związki identyfikowano na podstawie porównania czasu retencji analizowanego piku z czasem retencji wzorca oraz przez dodanie określonej ilości wzorca do analizowanych próbek i powtórzenie analizy. Poziom wykrywania wynosić będzie 1 μg/g.
• Aktywność przeciwutleniająca. W celu analizy aktywności przeciwutleniającej ekstraktów pozyskanych z surowca przeprowadzono reakcję z kationorodnikiem ABTS. Następnie przeprowadzono ilościową analizę powstałych produktów reakcji zmiatania wolnych rodników za pomocą spektrofotometru Helios Thermo Electron Corp. Standardem zewnętrznym był Trolox Wyniki wyrażono w ABTS•+ (µmolTROLOX/kg) s.m. próbki.
• Związki fenolowe ogółem. Całkowita zawartość związków fenolowych została oznaczona za pomocą metody z odczynnikiem Folin-Ciocalteu przy pomocy spektrofotometru Helios Thermo Electron Corp. Wyniki wyrażono w mg kwasu galusowego/kg s.m. próbki.
• Barwniki roślinne w tym chlorofil. Barwniki roślinne wyekstrahowano za pomocą wodnego roztworu EtOH (60%), rozdzielone metodą chromatografii kolumnowej. Ekstrakty przeanalizowano na zawartość poszczególnych barwników ogółem za pomocą Spektrofotometru UV/VIS Excellence, 6850. Następnie ilościową zgodnie z krzywą wzorcową obliczono zawartości poszczególnych barwników w tym frakcji chlorofilowych.
• Zawartość cukrów ogółem. Oznaczenie zawartości cukrów ogółem przeprowadzono metodą Bertranda. Jest to klasyczna metoda pośredniego miareczkowania. Ilość cukrów oblicza się na podstawie objętości manganianu(VII) potasu zużytego na miareczkowanie jonów Fe+2, odpowiadających ilości miedzi zredukowanej przez sacharydy redukujące zawarte w badanym roztworze cukrów.
• Zawartość kwasów organicznych ogółem. W celu oznaczenia kwasów organicznych ogółem zastosowano metoda potencjometryczna wg PN-90/A75101/04 Oznaczanie kwasów organicznych ogółem. Przetwory owocowe i warzywne.
W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono:
• niewielkie różnice związane z cechami odmiany, jakość towaroznawcza ziaren mieściła się w klasie A tj. najlepszej do dalszych procesów przetwórczych,
• że badany materiał cechowała zróżnicowana aktywność enzymów z grupy peroksydaz, oraz co najważniejsze pełne bezpieczeństwo
• zróżnicowanie badanych odmian pod kątem zawartości witamin, minerałów i innych składników aktywnych mierzonych ilościowo i aktywnością przeciwutleniającą.
Uzyskana nowa wiedza na temat analizowanych odmian groszku cukrowego, razem z pozostałymi danymi polowymi i genetycznymi, posłużą do wyboru w kolejnym trzecim etapie realizacji operacji, odmian o najwyższym potencjale do dalszych procesów przetwórczych.
Analizy mikrobiologiczne
Ocena towaroznawcza obejmowała również analizy mikrobiologiczne zgodne z ROZPORZĄDZENIEM KOMISJI (WE) NR 2561/1999 (ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 2561/1999 z dnia 3 grudnia 1999 r. ustanawiające normę handlową dla grochu. https://www.prawo.pl/akty/dz-u-ue-l-1999-310-7,67516721.html):
• Ogólna liczba drobnoustrojów,
• Ogólna liczba pleśni i drożdży,
• Liczba bakterii beztlenowych przetrwalnikujących redukujących siarczany (IV),
• Listeria spp., Salmonella spp.
Wyniki przeprowadzonych analiz potwierdziły ogólne niskie zanieczyszczenie bakteriami mezofilnymi oraz pleśniami i drożdżami. Nie stwierdzono obecności bakterii patogennych co świadczy o właściwych praktykach podczas uprawy, zbioru i transportu surowca oraz pełnym bezpieczeństwie surowca kierowanego do dalszego przerobu.
 |
|---|
 |  |
|---|
 |
|---|
 |
|---|
 |  |
|---|
INWESTYCJA
W ramach realizacji operacji, Lider operacji tj. Zakład Przetwórstwa Owocowo-Warzywnego w Środzie Wlkp. Sp. z o.o., dokonał pierwszej inwestycji. Zakupiony nowoczesny sorter optyczny do groszku po wstępnych testach pracuje już w zakładzie. Inwestycja ta posłuży do realizacji prac przewidzianych w etapie 3 i jest kluczową by na wczesnym etapie można dokonać selekcji surowca (po blanszowaniu czy mrożeniu) o zmienionej, nieodpowiedniej barwie. Taka innowacja w organizacji pracy będzie skutkowała przede wszystkim wczesną eliminacją produktów niezgodnych,
a w konsekwencji eliminacją dodatkowych nakładów na utrzymanie go np. w stanie zamrożenia.
DZIAŁANIA PROMOCYJNE
Uzyskane w ramach 1 i 2 drugiego etapu wyniki realizacji operacji, pozwoliły podjąć zespołowi badaczy z Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oraz pracowników Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie Oddział w Poznaniu, wielu działań promocyjnych o zasięgu krajowym i międzynarodowym.
1. Konferencja pn.: „Współpraca Producentów Rolnych sposobem na rozwój Rolnictwa i Obszarów Wiejskich” 5 września 2023 r. zorganizowana przez Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie Oddział w Poznaniu. Spotkanie to cieszyło się dużym zainteresowaniem i stało się znakomitą platformą do zaprezentowania przez prof. UPP dr hab. Joannę Kobus-Cisowską - wykonawczynię projektu, podstawowych założeń i prac prowadzonych w ramach operacji.
2. III Szczyt Polskich Grup Operacyjnych EPI, 14-15.11.2023 organizowany przez Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie, Oddział w Warszawie. Szczyt był wydarzeniem realizowanym w ramach Sieci na Rzecz Innowacji w Rolnictwie i na Obszarach Wiejskich (SIR), a jego celem ułatwienie nawiązywania kontaktów między polskimi Grupami Operacyjnymi, a także wymiana doświadczeń w realizacji projektów, które dotyczą opracowania i wdrożenia innowacyjnych rozwiązań w produkcji rolniczej, przetwórstwie czy dystrybucji produktów rolno-spożywczych. Grupa Operacyjna GROSZEK PREMIUM miała na tym spotkaniu również swoich przedstawicieli, pracowników Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu na czele z kierownikiem badań dr inż. Tomaszem Szablewskim oraz brokera innowacji Pana Przemysława Lecyka z Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie, Oddział w Poznaniu. Spotkanie cieszyło się ogromnym zainteresowaniem i umożliwiło na szerokim forum, upowszechnianie rezultatów projektów zarówno tych już zakończonych, jak i będących w trakcie realizacji.
 |  |
|---|
 |
3. 47 Międzynarodowe Seminarium Naukowo-Technicznego „Chemistry for Agriculture” 26-29 listopada 2023 w Karpaczu. W Seminarium uczestniczyli specjaliści z dziedzin chemii i biologii środowiska, technologii i biotechnologii, prowadzących badania o tematyce z pogranicza chemii i biologii. Pod przewodnictwem kierownika naukowego projektu dra inż. Tomasz Szablewskiego, interdyscyplinarny zespół przedstawił wstępne wyniki badań uzyskanych w trakcie realizacji projektu w postaci plakatów pt.:
a. Ocena poziomu zanieczyszczenia mikotoksynami i pozostałościami pestycydów groszku cukrowego. Agata Biadała, Kinga Stuper-Szablewska, Danuta Kurasiak-Popowska, Maciej Buśko, Tomasz Szablewski.
b. Peroksydazy – charakterystyka, zawartość i aktywność w nasionach grochu. Danuta Kurasiak-Popowska, Agnieszka Tomkowiak, Kinga Stuper-Szablewska, Tomasz Szablewski.
c. Analiza bezpieczeństwa groszku cukrowego w ramach projektu „ GROSZEK PREMIUM”. Dariusz Świerk, Renata Cegielska-Radziejewska, Łukasz Tomczyk, Patryk Antoszewski, Joanna Kobus-Cisowska, Tomasz Szablewski.
Zaprezentowane wyniki realizacji operacji, cieszyły się dużym zainteresowaniem, a przybyli na seminarium naukowcy z innych ośrodków w trakcie licznych dyskusji zgodnie orzekli, że siłą naszej grupy operacyjnej jest interdyscyplinarny zespół badawczy, wysoka jakość badań i komplementarne podejście do rozwiązania tematu.
