Realizacja operacji – etap 1
W etapie 1 projektu przeprowadzono badania dotyczące doboru najkorzystniejszych odmian groszku cukrowego spośród dostępnych na rynku pod względem określenia zawartości kopii genów odpowiedzialnych za syntezę peroksydaz. Prace zrealizowano w warunkach polowych w Gospodarstwie Rolnym Jan Rajewicz. W ramach tych prac wyselekcjonowano odmiany groszku najbardziej odpornego na niekorzystne zmiany organoleptyczne wywoływane małą koncentracją peoksydaz.
Doświadczenie polowe
Materiał roślinny w roku 2023 stanowiło 15 odmian grochu siewnego. W warunkach polowych, u Rolnika, wiosną 2023 wysiano 15 odmian grochu siewnego na powierzchni 2 ha. Odmiany do doświadczenia polowego wybrano na podstawie długości okresu wegetacji, uzyskiwanej wielkości i jakości plonu oraz jego przydatności do uprawy. W trakcie prac polowych wykorzystano zasady dobrej praktyki rolniczej oraz zalecenia hodowców. W trakcie sezonu wegetacyjnego oceniono następujące cechy: ocena wschodów, początku kwitnienia, ocena stanu ogólnego, wyleganie roślin, równomierność dojrzewania, wysokość i sztywność roślin, liczba strąków, masa 1000 nasion, wilgotność podczas zbioru i plon ziarna. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono zróżnicowanie fenotypowe roślin co w dalszych etapach realizacji operacji pozwoli na wybór optymalnych odmian do warunków prowadzenia kolejnych doświadczeń polowych realizowanych w etapie 3.
 |  |
|---|
 |
Analizy molekularne
Analiza genetyczna wybranych odmian grochu przeprowadzono w laboratorium Katedry Genetyki i Hodowli Roślin Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu pod kątem obecności i ilości kopii wybranych genów kodujących zestaw enzymów z grupy peroksydaz). Materiałem roślinnym użytym do badań molekularnych było 15 odmian grochu. Każda odmiana analizowana była w trzech powtórzeniach biologicznych i dwóch wariantach technicznych. Łącznie analizom poddano 90 roślin (15 genotypów x 3 powtórzenia biologiczne x 2 warianty techniczne). Pierwszy etap analiz molekularnych stanowiła izolacja mRNA z 90 genotypów grochu (izolacja przeprowadzona została z wykorzystaniem aparatury i zestawu do izolacji Maxwell® RSC Plant RNA Kit). Izolacja wykonana została zgodnie z procedurą dołączoną do zestawu. Koncentracja mRNA sprawdzona została za pomocą spektrofotometru DeNovix. W kolejnym etapie przeprowadzono reakcja odwrotnej transkrypcji przy użyciu kitu iScript™ Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR z firmy BIO-RAD. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że wydajność pojedynczej izolacji była niska i wahała się od 75,68 ng/ul dla genotypu SV0969QH do 206,98 ng/ul dla genotypu SV0969QH, natomiast co ważne czystość poszczególnych próbek była bardzo dobra i mieściła się w zakresie od 1.54 (Scherwood) do 2.39 (PA0826) dla absorbancji 260/280 oraz 1,85 (Ashton) do 2,20 (Hyperion). Próbki otrzymanego cDNA doprowadzono do jednakowego stężenia 100ng/ul do wykorzystania w 2 etapie realizacji operacji tj. do analizy ekspresji genów 90 genotypów grochu.
 |
 |
 |
Ocena towaroznawcza groszku
Zgodnie z Normą Branżową (BN-84/8165-07), ziarno groszku przeznaczone do mrożenia zostało poddane ocenie towaroznawczej realizowane w Katedrze Zarządzania Jakością i Bezpieczeństwem Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, polegającej na określeniu:
• Zawartości (%) ziaren uszkodzonych i zlepieńców trwałych,
• Barwy (ocena procentowego udziału ziaren żółtych i ze skazami),
• Wielkość ziaren,
• Zdrowotność,
• Smaku i zapachu,
• Konsystencji (twardość),
W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono niewielkie różnice związane z cechami odmiany, jakość towaroznawcza ziaren mieściła się w klasie A tj. najlepszej do dalszych procesów przetwórczych.
Ocena towaroznawcza obejmowała również analizy chemiczne w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, zgodne z Norma Branżową (BN-84/8165-07):
• Aktywność enzymatyczna
Analiza przeprowadzona została metodą spektrofotometryczną zgodna z protokołem analitycznym zawartym w PN-80/R -7 5763 Warzywa świeże. Groch zielony
• Zawartość związków nierozpuszczalnych w alkoholu (AIS), zastosowano standardową metodę (metoda A) oznaczania substancji alkoholowo nierozpuszczalnych, które decydują o przydatności zielonego grochu na mrożonki i konserwy (AO AC 1984, s. 608), oparta jest na ekstrakcji pulpy wodnej grochu 80-procentowym alkoholem oraz wielokrotnym przemywaniu alkoholem próbek na sączku i bezpośrednim wyliczaniu procentowej zawartości substancji nierozpuszczalnych w alkoholu. Metoda ta została porównana z metodą wodno-etanolową (metoda B) zmodyfikowaną w następujący sposób: sączenie zastąpiono wirowaniem próbek, uzyskując supernatant części rozpuszczalnych w etanolu. Procent wagowy składników rozpuszczalnych w etanolu (a) i nierozpuszczalnych w etanolu (y) obliczono zostanie ze wzoru: y = [100(s — a)]:[100 — a], gdzie s = procent wagowy suchej masy.
• Zanieczyszczenia chemiczne (mikotoksyny, pozostałości pestycydów)
Wykonano analiza dziesięciu pestycydów (2,4 DDE, alfa-endosulfan, bifentryna, chlorpyrifos, dieldryna, fosalon, kaptan, keton endryny, siarczan endosulfanu oraz tolchlofos metylowy) i ich metabolitów w próbkach groszku metodą chromatografii gazowej sprzężonej z detektorem spektrometrii mass (GC-MS). Pestycydy zostały wyekstrahowane, a następnie poddane izolacji z wykorzystaniem techniki SPE (metoda QuEChERS).
• Analiza mikotoksyn (trichoteceny grupy A i B, zearalenon, ochratoksyna A, aflatoksyny i fumonizyny) w zależności od zidentyfikowanych podczas wegentacji roślin chorób grzybowych. Analiza mikotoksyn przeprowadzona została po wcześniejszej ich ekstrakcji miesznina acetonitryl/woda 82:18 v/v. Następnie ekstrakty oczyszczono i rozdzielono za pomocą kolumnienek SPE z wypełnieniniem dedykowanym dla poszczególnych mikotoksyn. Analiza ilościowa mikotoksyn została przeprowadzona za pomocą chromatografii gazowej (GC-MS) oraz cieczowej UPLC-PDA/fluorymetryczny.
W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że badany materiał cechowała zróżnicowana aktywność enzymów z grupy peroksydaz, oraz co najważniejsze pełne bezpieczeństwo (11 pestycydów >LOD, 10 mikotoksyn >limitów).
Ponadto ocena towaroznawcza obejmowała również analizy mikrobiologiczne zgodne z ROZPORZĄDZENIEM KOMISJI (WE) NR 2561/1999 (ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 2561/1999 z dnia 3 grudnia 1999 r. ustanawiające normę handlową dla grochu. https://www.prawo.pl/akty/dz-u-ue-l-1999-310-7,67516721.html):
• Ogólna liczba drobnoustrojów (PN-EN ISO 4833-1:2013-12)
• Ogólna liczba pleśni i drożdży (PN-ISO 21527-1:2009)
• Liczba bakterii beztlenowych przetrwalnikujących redukujących siarczany (IV) (PN-ISO 15213:2005),
• Listeria spp., Salmonella spp.
W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono niskie zanieczyszczenie badanymi grupami bakterii oraz brak obecności patogennych mikroorganizmów.
